Dvořák vader František Dvořák had een restaurant en een slagerij, die hij van zijn vader had geërfd. Zijn moeder Anna Zděnková was een dochter van een rentmeester. Hun huwelijk werd op 17 november 1840 voltrokken; Antonín was het eerste van negen kinderen.
Op 6-jarige leeftijd ging hij op school in Nelahozeves en kreeg hij van zijn leraar de eerste vioollessen. In 1853 vertrok hij naar Zlonice om Duits te leren, want deze taal was in Bohemen, dat toen deel van Oostenrijk was, belangrijk. Bij Antonín Liehmann, de dirigent van het kerkkoor in Zlonice, kreeg hij piano- en orgelles. Hij speelde in het kleine orkest van zijn leraar mee en begon met componeren.
In de herfst van 1856 ging Dvořák naar Česká Kamenice, verbeterde zijn kennis van de Duitse taal en studeerde bij František Hancke. Vanaf oktober 1857 ging hij op de Duitstalige Praagse orgelschool en volgde hij algemeen openbaar onderwijs. Hij werd altviolist in het orkest van de Caeciliavereniging, die twee keer per jaar een optreden verzorgde.